樹豆酮酸A是從豆科植物樹豆[Cajanus cajan（Linn.）Millsp.]葉中 分離出的一種新的菧類化合物。已有體內(nèi)外研究證 實，CAA作為肥胖癥特異性靶點蛋白酪氨酸磷酸酶1B （PTP1B）抑制劑，可明顯提高胰島素抵抗脂肪細(xì)胞對葡 萄糖的吸收量，并可降低先天肥胖型小鼠的體質(zhì)量和空 腹血糖水平、提高其葡萄糖耐受量，具有開發(fā)成糖尿病 治療藥物的潛力和價值。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate 3000 型 UPLC-TSQ Endura 型三重四極桿 串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）和Xcalibur v2.2數(shù) 據(jù)處理系統(tǒng)（美國Thermo Finnigan公司）；JN300-2型氮 氣吹掃儀（蘇州吉米諾儀器有限公司）；X1型高速離心 機（香港基因有限公司）；KQ5200DE型超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；FA805N型十萬分之一電子 天平（上海菁海儀器有限公司）；DW-86L486型超低溫保 存箱（青島海爾股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

CAA對照品（貴州醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)重點實驗室制備，批號：20180521，純度：＞98％）；染料木素對照品（內(nèi) 標(biāo)，批號：528C021，純度：＞98％）、煙酰胺腺嘌呤二核苷 酸磷酸二鈉（NADP-Na2，批號：718B0225）、葡萄糖-6-磷 酸-二鈉（G-6-P-Na2，批號：116B039）、葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶（G-6-P-DH，批號：20160725）均購自北京索萊寶科 技有限公司；雄性 SD 大鼠肝微粒體（批號：M10017. 2017002）、雄 性 比 格 犬 肝 微 粒 體（批 號 ：M10007. 2017002）、人肝微粒體（男性健康蒙古利亞人種，批號： M10001.2017003）均購自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限 公司，質(zhì)量濃度均為20 g/L（以蛋白計）；甲酸、甲醇、乙腈 均為色譜純，氯化鎂、檸檬酸鈉等其余試劑均為分析純， 水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 CAA 和內(nèi)標(biāo)溶液

精密稱取CAA 對照品適量， 用甲醇溶解并定容，制得質(zhì)量濃度為1 mg/L的CAA貯 備液；同法制得質(zhì)量濃度為1 mg/L的內(nèi)標(biāo)貯備液；上述 貯備液均置于4 ℃保存，備用。臨用前，將CAA貯備液 與適量甲醇、0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4；下 同）、肝微粒體、輔酶溶液等混合，制備孵育體系；將內(nèi)標(biāo) 貯備液用甲醇稀釋，制得質(zhì)量濃度為 2 μg/mL 的內(nèi)標(biāo) 溶液。

2.1.2 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）輔酶溶液

A 液：依次加入 NADP-Na2、G-6-P-Na2、氯化鎂 200、200、133 mg，用水定容至10 mL。B液：依次加入檸 檬酸鈉、G-6-P-DH 44 mg、1 000 U，用水定容至 25 mL。 將A、B液均置于－20 ℃保存，備用。臨用前，將A、B液 按體積比 5 ∶ 1 混合，制得濃度為 1 mmol/L（按反應(yīng)產(chǎn)物 NADPH計）的輔酶溶液。

2.2 樣品孵育與處理

2.2.1 孵育體系的建立

取大鼠、比格犬、人肝微粒體 各適量，用 PBS 稀釋至 0.5 g/L，隨后加入“2.1.1”項下 CAA貯備液適量，使CAA最終質(zhì)量濃度為5 μg/mL，同 時確保孵育體系中甲醇的含量不超過1％。將上述溶液 置 于 37 ℃ 水 浴 中 靜 置 5 min 后 ，加 入“2.1.2”項 下 NADPH 輔酶溶液以啟動反應(yīng)。該體系總體積為 200 μL，其中NADPH的終濃度為1 mmol/L，有機溶劑不超過 5％。

2.2.2 樣品孵育與處理

將上述孵育體系繼續(xù)置于37 ℃水浴中進行孵育，分別于孵育 0、5、10、15、30、45、 60 min時，加入含內(nèi)標(biāo)（2 μg/mL）的乙腈400 μL終止反 應(yīng)，渦旋混勻30 s，于4 ℃下以16 000×g離心10 min，取 上清液以氮氣流吹干，殘渣用甲醇 200 μL 復(fù)溶，再以 16 000×g離心10 min，取上清液適量進行UPLC-MS/MS 分析，考察各時間點待測物的含量。各孵育體系均平 行操作3次。

3 討論

肝臟是代謝的主要器官，是藥物進行生物轉(zhuǎn)化的重 要場所。在這個復(fù)雜的生理過程中，藥物被各種代謝酶 分解、轉(zhuǎn)化成不同的分子（即代謝物）以發(fā)揮其藥理活 性。與體內(nèi)代謝研究相比，體外代謝研究具有成本低 廉，操作方法簡便、快速，結(jié)果重現(xiàn)性好等優(yōu)點，適用于 新藥研發(fā)候選化合物代謝行為的早期研究及篩選。 為此，本研究對 CAA 在不同種屬肝微粒體中的代謝行 為進行了初步探討。