慢性心力衰竭( chronic congestive heart failure，CHF) 是 大多數(shù)心血管疾病的最后歸宿和死亡原因，發(fā)病率也逐年 上升，我國(guó)已達(dá) 0． 9% ，老年人群的發(fā)病率達(dá) 1． 3%。 且老年心力衰竭患者的住院時(shí)間長(zhǎng)，再入院率高，生活質(zhì)量 差。雖然 CHF 的住院率占同期心血管病的 20% ，但死亡率 卻占 40%，提示其預(yù)后的嚴(yán)重性，情況不容忽視。加參 片處方來(lái)源于臨床經(jīng)驗(yàn)方。

1 儀器與材料

1． 1 儀器

超高效液相色譜系統(tǒng) ACQUITY UPLC ( 美國(guó) Waters 公 司) ，PDA 檢 測(cè) 器 ( 美 國(guó) Waters 公 司) ，Waters Q － TOFPremier 質(zhì)譜儀( 英國(guó) Waters MS Technologies 公司) ，數(shù)據(jù) 處理軟件為 MasslynxTM4． 1 和 Metabolynx( 美國(guó) Waters 公 司) ; Mettler Toledo XS205 分析天平( 瑞士 Mettler Toledo 公 司) ; KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗儀( 昆山舒美超聲儀器有限公司) ; Milli － Q 超 純 水 系 統(tǒng) ( 美 國(guó) Millipore 公 司) ; ST16Ｒ 高速冷凍離心機(jī)( 美國(guó) Thermo 公司) 。

1． 2 材料

試劑: 甲醇( 質(zhì)譜級(jí)，德國(guó) Merck 公司) ，乙腈( 質(zhì)譜級(jí)， 德國(guó) Merck 公司) ，乙酸乙酯( 色譜級(jí)，天津市康科德科技 有限公 司) ，甲 酸 ( 色 譜 級(jí)，德 國(guó) Merck 公 司) ，超 純 水 ( Milli － Q 制備) ，肝素鈉( 160 μ/mg，南京奧多福尼生物科 技有限公司) 。試藥: 加參片提取物( 批號(hào) 20161103，天士 力研究院現(xiàn)代中藥研發(fā)中心提供) 。動(dòng)物: 雄性 Wistar 大 鼠，體質(zhì)量( 200 ± 20) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù) 有限公司。

2 方法

2． 1 色譜與質(zhì)譜條件

2． 1． 1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 ( 2． 1 mm × 100 mm，1． 7 μm) 。流動(dòng)相 0． 1% 甲酸水( A) － 甲醇( B) ; 梯度洗脫: 0 ～ 3 min，10% ～ 10% B; 3 ～ 11min， 10% ～ 20% B; 11 ～ 21 min，20% ～ 40% B; 21 ～ 35 min， 40% ～ 70% B; 35 ～ 37 min，70% ～ 95% 。流速 0． 3 mL· min － 1 ; PDA 全波長(zhǎng)掃描; 柱溫 30 ℃ ; 進(jìn)樣量 2 μL。

2． 1． 2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子化源( ESI) ，MSE 掃描 正負(fù)離子模式檢測(cè)，掃描范圍 m/z50 ～ 1500，用亮氨酸腦啡 肽作校正液，進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。毛細(xì)管電壓負(fù)離子模式 2． 3 kV，正離子模式 2． 8 kV，錐孔電壓為 40 V，霧化氣為高純度 氮?dú)?，流速?50 L/h，碰撞氣為氬氣，脫溶劑氣流速 800 L/ h，脫溶劑溫度為 350 ℃，離子源溫度為 120 ℃。高能量掃 描時(shí) trap 電壓為 20 ～ 60 eV。

2． 2 灌胃液制備

按照加參片中藥材提取工藝對(duì)各藥材進(jìn)行提取，其中丹參、香加皮、黃芪、三七采用稀醇提取大孔樹(shù)脂純化等技 術(shù)制備提取物，桂枝、益母草等采藥材用水提醇沉等技術(shù)得 到提取物，經(jīng)現(xiàn)有的內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)為制備加參片制劑 合格的加參片提取物，按比例混合。取加參片全方提取物 2． 758 g，缺香加皮陰性提取物 2． 64 g，香加皮提取物 0． 122 g，各 加 10 mL 二 純 水 溶 解，制 得 濃 度 分 別 為 0． 275 8， 0. 264，0． 012 2 g /mL 的供試品溶液。

2． 3 血漿樣品的制備

Wistar 大鼠適應(yīng) 1 周后，將 8 只大鼠隨機(jī)分為 4 組，3 個(gè)給藥組( 加參片提取物全方組、缺香加皮陰性提取物組、 香加皮提取物組) 每組 2 只，空白組 2 只。實(shí)驗(yàn)前禁食 24 h，自由飲水，給藥組分別以 4． 137、3． 95、0． 183 6 g /kg( 均基 于預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定) 的給藥量灌胃加參片提取物全方提取 液，缺香加皮陰性提取物提取液，香加皮提取物提取液，分 別在 5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、1． 5 h、2 h、3 h、5 h、7 h 眼靜脈從采集血液各 500 μL，血液置于含有肝素鈉的 EP 管中，4500 r/min 離心 10 min ，取上清液血漿。各點(diǎn)各取 150 μL，加 4 倍量甲醇，渦旋振蕩 2 min，離心 15 min( 4 ℃， 14 100 r/min) ，取上清液，35 ℃氮?dú)獯蹈?，再加?100 μL 初 始流動(dòng)相復(fù)溶( 甲酸水 － 甲醇 9 ∶ 1) ，超聲 1 min，渦旋振蕩 2 min，離心 15 min( 4 ℃，14 100 r/min) ，上清液轉(zhuǎn)移至液 相內(nèi)插管中待用分析。

3 結(jié)果

含藥血漿、空白血漿各進(jìn)樣 4 μL，按 2． 1 項(xiàng)下的色譜 與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，采用 MSE 掃描正負(fù)離子檢測(cè)，獲得 的正、負(fù)離子模式下的 BPI 圖通過(guò)色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰信息( MS) 、碎 片離子信息( MS /MS) ，及在加參片提取物 化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，共指認(rèn)出 14 個(gè)入血原型成分 ( 表 1) ，5 個(gè)代謝產(chǎn)物。M2、M3: 負(fù)離子模式下，在 m/z 459． 09 的提取流色譜 圖中，可以檢測(cè)到兩個(gè)代謝產(chǎn)物的色譜峰，保留時(shí)間分別為 20． 337 min( M2) 和 25． 675 min( M3) 。其中 M2 的二級(jí)質(zhì) 譜中出現(xiàn) m/z 459． 091 7，m/z 283． 057 8，m/z 268． 034 2， m/z 175． 019 0 等一系列碎片離子，體外樣品溶液毛蕊異黃 酮 － 7 － O － b － D － 葡萄糖苷也出現(xiàn) m/z 283． 057 8，m/z 268． 034 2 的碎片離子，毛蕊異黃酮的［M － H］－ 分子離子 m/z 283． 057 8 比 m/z 459． 092 2 多 176 Da，M3 的二級(jí)碎片也存在 m/z 283． 057 3，m/z 269． 040 6，m/z 175． 008 8 的碎 片離子，且 M2 的峰面積大于 M3，依據(jù)碎片離子信息推斷 M2 為毛蕊異黃酮 － 7 － O － b － D － 葡萄糖 醛酸，M3 為毛蕊異黃酮 － 3’－ O － b － D － 葡萄糖醛酸( m/ z 175． 019 0 是葡萄糖醛酸的特征離子峰) 。

4 討論

課題組前期進(jìn)行的加參片提取物化學(xué)成分研究中， 所開(kāi)發(fā)的方法在入血成分分析中仍然適用，所以本實(shí)驗(yàn)所 采用的色譜與質(zhì)譜方法同前期開(kāi)發(fā)加參片提取物化學(xué)成分 方法一致。給藥血漿各采血點(diǎn)各取 20 μL 血漿 混合，加入 4 倍量甲醇，渦旋振蕩 2 min，離心 15 min( 4 ℃，14 100 r/min) ，取上清液，35 ℃ 氮?dú)獯蹈?，再加?100 μL 初始流動(dòng)相復(fù)溶( 0． 1% 甲酸水 － 甲醇 9 ∶ 1) ，超聲 1 min， 渦旋振蕩 2 min，離心 15 min( 4 ℃，14 100 r/min) ，上清液 轉(zhuǎn)移至液相內(nèi)插管中，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析檢測(cè)。以峰個(gè)數(shù)、分離度、峰面積的大小等因素來(lái)確定血漿處 理方法。由圖 3 可以看出，乙酸乙酯萃取處理法，出峰個(gè)數(shù) 較少，其更適用于中等極性或者弱極性的成分，而對(duì)極性較 大的成分選擇能力較弱?；诩訁⑵崛∥锴捌诨瘜W(xué)成分 的研究，方中極性成分占多數(shù)，故舍棄乙酸乙酯萃取法。 有機(jī)溶劑甲醇沉淀法，出峰個(gè)數(shù)較多，富集度高，分離效 果也較好，且得到的峰面積較乙腈沉淀法和甲醇乙腈沉 淀法高，最終確定用甲醇沉淀法作為血漿的前處理方法。



 

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